Charles River推出GMP级NGS病毒载体和质粒鉴别

引言

在设计制剂的放行检测方案时，生产商必须充分证明该批次制剂的安全性并确保其质量与纯度。对于用于细胞和基因治疗的产品，监管规定中将药物鉴别、安全性、质量、纯度和强度作为其关键质量属性（CQA）[1,2]。在本应用指南中，我们将重点介绍病毒载体生产和质粒材料质量控制中的鉴别（通常缩写为ID）要求。

从根本上说，药物鉴别试验可保证成品与产品描述一致，并能与同一工厂的类似产品区分开来。FDA《联邦法规法典》第21篇第610部分[3]规定，生物制品（或生物制剂）鉴别性状应为：

产品的物理或化学特性，采用宏观或微观方法，特定的培养试验，或者体外或体内免疫学测试进行检测。摘自21 CFR 610.14 [3]

对于携带遗传物质的病毒载体，如慢病毒或腺病毒相关病毒（AAV），不同产品之间的外部物理化学和免疫学特征可能非常相似。因此，还必须检测病毒载体的遗传物质[1,2]。通过目标区域PCR扩增或整体或靶向Sanger测序的方法可以实现这一点。然而，随着NGS技术应用越来越广泛，病毒载体厂商和监管部门都注意到NGS技术可以提供更丰富的数据集，既能更好地了解生产过程，又能增强对品质的信心。例如，NGS技术成功应用于确定遗传亚群的存在，包括病毒载体成品批次中极罕见的突变。

测序技术概览

下一代测序，或称大规模并行测序（MPS）、高通量测序（HTS），由一系列技术平台组成，可获取丰富的样本核苷酸序列数据集。通常，NGS技术平台包括短读或长读技术。短读技术（如Illumina）每次可读取提供最多350个碱基的序列信息。长读技术（如Oxford Nanopore）每次可读取高达数千个碱基的序列信息。每次NGS测序都会产生大量数据，因此必须采用复杂的生物信息学技术处理来汇编和呈现需要解读的数据（图1）。短读往往比长读更为灵敏，因此非常适用于外源因子检测以及低丰度遗传变异检测等。然而，由于这些短序列数据需汇编成共有序列数据才更有使用价值，生物信息学操作可能会更复杂，尤其是当参考序列非常有限时。

图1 NGS短读序列比对多达350个碱基的每个序列“读数”与参考序列比对后得到共有（或输出）序列。上图A显示的是读数的放大图形比对。下图B显示的是单个碱基序列比对。图B中突出显示了参考序列和共有序列之间的差异，以及单条读数差异。

Sanger测序广泛应用于产品鉴别测试以及多方面的性状描述，并符合监管要求。该方法使用引物产生一系列扩增子，通常长度可达1000个碱基。通过毛细管电泳（CE）确定共有序列，用荧光检测确定终止碱基的位置（图2）。如果样本碱基数若达到1000以上，则需要额外设计的引物才能完成所有单独测序，增加了成本与劳动力。此外，引物端序列和扩增子末端序列通常质量较差。因此，用Sanger技术对1000个碱基片段完全测序需要2到3次单独的引物设计和反应，那么对于AAV（5 kb）或慢病毒基因组（10 kb）完整测序可能需要10至30次反应才能完成。此外，对于DNA二级结构和复杂的核苷酸序列，引物延伸会受到阻碍，比如AAV基因组中的末端反向重复（ITR）序列。因为突变会经常发生，并且基序与载体和相关质粒的结构和功能有关，所以要特别注意，使用Sanger测序来破解这些基序难度很大。[4]

图2 Sanger测序图在反应过程中（左图），寡核苷酸引物在含有荧光染料标记的终止子的环境中与靶序列配对延伸，生成不同长度带有末端标记的扩增子。采用毛细管电泳（CE）得到每个扩增子准确的碱基序列长度（右图），根据扩增子荧光信号位点来获得共有序列。

Charles River利用NGS短读技术，提供GMP级鉴别检测服务。图3简要展示了NGS短读技术流程。将DNA待测序列片段化为200-500 bp的片段。对于RNA待测序列，将其逆转录为DNA后再进行片段化。接着将碱基片段两端与测序接头连接，在流动池中从片段的某一段端开始测序。因此，尽管限制单条片段最长为350个碱基，但只要充分片段化待测DNA，便能测量每个片段的完整序列。

图3 NGS短读流程图。将待测DNA或RNA逆转录产物切分后，将各片段两端与测序接头连接，制备文库。在流动池中进行测序，采用生信分析处理输出数据。

NGS技术相较于Sanger测序的优点

历史上，Sanger测序一直都为监管部门所认可，而如今NGS技术受到青睐，因为该技术具有提供病毒载体以及质粒的完整全面的序列信息的优势：

• 成本低  

 对AAV或慢病毒基因组（分别为5 kb或10 kb）进行完整测序可能需要10至30次Sanger测序反应。虽然单次Sanger测序通常比NGS成本更低，但并行多次Sanger反应的成本高昂，尤其是在设计和检测需要多对引物的情况下。

• 省时   

对于单次测序或优化某一特定样本时，Sanger测序速度更快（GMP检测服务通常为1-2周）。但是，如果样本没有提前进行测序验证，那么将花费大量的时间。

• 复杂结构测序   

对于DNA二级结构和高度重复区域如富含GC碱基对的序列和poly-A，特殊病毒序列如AAV ITR区或慢病毒LTR区，以及一些启动子和调控区域，采用NGS测序更加方便。而在Sanger测序中，这些区域将严重阻碍引物延伸。

• 高精度突变检测   

突变检测非常重要，不仅关系到成品的质量，并且还关系到质粒原材料的质量。Sanger测序本质上是一种获得共有序列的方法，虽然可以识别序列中的变异或亚群，但只有在变异存在20%以上时，其识别结果才可靠。即便在此水平上，电泳图谱的解读也带有很强的主观性。相比之下，理论上，NGS技术可以检测出单个变异，而在实践中，确认变异需要经过多次读数。因此，即使变异存在于1%以下的群体中，采用NGS进行突变检测也是可行的。值得注意的是，在某一样本中估算遗传变异相对丰度时，NGS应被视为一种半定量而非完全定量的方法，因为量化取决于序列覆盖度以及被测序列的质量。因此，在设置NGS测序结果标准时应考虑这一点。

图4 Sanger测序和NGS技术优势对比

病毒载体鉴别检测

如上所述，病毒载体产品的测序方法通常需要作为监管提交流程的一部分，以确认其鉴别结果并保证生产一致性。Sanger测序满足该产品发行标准，而NGS技术用于病毒载体鉴别具有许多优点。

成本效益是一个具有说服力的优势，但在选择检测方法时，成本因素通常是次要的。NGS技术通常更具成本效益，这无疑是该技术的一个优势，因为对于完整测序，Sanger法可能需要大量的并行检测。前文也讨论了Sanger测序在诸如AAV ITR区或慢病毒LTR区测序时可能遇到的挑战。NGS技术的物理化学机制解决了复杂序列测序可能面临的问题。

但是，用NGS技术鉴别病毒载体的最强劲优势是提供了更深入的产品质量信息。Sanger测序是一种获得共有序列的方法，其得到的序列是样本中总序列群体的平均值。而NGS技术提供了每个序列的信息，因此可以识别出非常低的突变率。在高成本的下游加工前需进行产品批次质量评估，那么这种精细的测量尤为重要。由于病毒载体被封装，在下游加工过程中，并不总能避免病毒基因组中可能发生的遗传变异。[5]

序列变异可由以下原因引起：

• 在病毒基因组转录过程中可能出现自发的变异、突变或重组，载体设计和生产条件中的许多因素或多或少存在一定影响。

• 成品中基因变异的最大来源是质粒。如果采用NGS技术检测病毒载体产物质量，那么同时应该用其检测质粒原材料的质量。

• 如果转录过早终止，或者基因组转录物特别不稳定，则在载体生产过程中可能出现不完整病毒基因组。生产条件可能会给生产单元带来额外的压力，从而造成一定影响。

• 此外，序列设计也可能导致不完整病毒基因组的出现，例如在目标终止点上游存在弱转录终止信号，而NGS技术可以有效评估不完整病毒基因组的情况。但这种测量是针对序列缺失的情况，可能不如检测遗传变化灵敏。同样要注意，NGS技术并不太适用于测量AAV载体空壳率，应考虑其他方法。

综上所述，在设计病毒载体鉴别方法时，NGS技术应成为首选方案。

质粒鉴别检测

作为GMP级生产工艺的一部分，所有原材料都必须进行充分的风险控制和测试。某些原材料比如生长培养基、生产细胞系或直接参与生产的质粒等，都被视为关键原材料，因此其需要有适当的供应缓解和测试程序。

当前大多数病毒载体生产技术使用瞬时转染方法，即组装病毒载体所需的组分从细胞系中的质粒表达，随后用于下游纯化。

质粒不构成最终产品，因此没有关于其鉴别的正式规定。但是质粒作为一种关键原料，应采用符合病毒载体鉴别要求的检测方案。

NGS技术非常适用于质粒的质控，该技术可以：

避免产生错误，保证在生产过程中序列自发整合到质粒中。例如，AAV ITR在扩增过程中容易出现整合错误[4]。

 从开始阶段就验证质粒群体的克隆性，以确保没有交叉污染。

在生产工艺的定义过程中，可以确定一小部分质粒变体亚群（如≤5%）是可接受的。然而，重要的是要了解这些变体在产品中的分布情况。例如，可能在质粒特定编码区之外的区域发生序列改变，这对产品质量没有影响。相反，变体也可以在编码序列或序列基序中产生对产品质量有显著影响的移码突变。综上所述，即使在相对较高的水平下，Sanger测序对以上任一情况的检测都不够灵敏。

Charles River & PathoQuest的鉴别服务

Charles River 为生物制药提供基于NGS技术的GMP级检测服务。我们提供已经过GMP全面验证的AAV、慢病毒等病毒载体的鉴别服务，以及可用于细胞及基因治疗、疫苗制造的CRISPR等非病毒载体生产的鉴别服务。

NGS短读测序平台具有出色的低突变率检测能力。由于验证方面的限制，GMP服务仅可检测序列丰度为5%或更高的变体。然而，由于读数的丰度较高，此测序平台虽然可以检测并报告序列丰度小于1%的变异，但相对定量的准确性可能会降低。从样本制备到测序到生信分析，我们的整个工作流程皆符合GMP要求，所获得的GMP分析证书中包括共有序列和序列丰度大于5%的变体序列。

*不同监管机构的生物安全等级分类可能有所不同——详情请联系我们。

**NGS技术在本应用中应视为半定量方法。丰度图是根据读数中的突变率提供的，如需要检测5%水平以下的变异，请与我们的专家联系。

参考文献

1.   Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products (EMA), EMA/CAT/80183/2014,Published March 2018

2.  Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) - Guidance for Industry (FDA) CBER, Published January 2020

3.   Code of Federal Regulations, Title 21 Volume 7. Part 610 – General Biological Products Standards (FDA) – accessed November 2022 at https://www.ecfr.gov/

4.   Wilmott, P., Lisowski, L., Alexander, I. E., & Logan, G. J. (2019). A user’s guide to the inverted terminal repeats of adenoassociated virus. Human Gene Therapy Methods, 30(6), 206-213.

5.   Srivastava, Arvind, et al. “Manufacturing challenges and rational formulation development for AAV viral vectors.” Journal of Pharmaceutical Sciences 110.7 (2021): 2609-2624.