高通量单细胞CRISPR基因编辑的原理及流程？

目前越来越多的文章发表关于利用10X单细胞平台对不同靶标sgRNA扰动后细胞内基因表达的研究，结果非常好。谁能够帮助介绍下实验原理和流程？最近实验室准备考虑做。不甚感谢

其实这个在10X官网上已经介绍得比较详细了，板砖如下：

单细胞分辨率的功能基因组学研究
以单细胞分辨率研究发育、疾病、基因功能和治疗反应的复杂性。单细胞CRISPR筛选能够获得全面且可扩展的细胞表型读数，从而直接评估CRISPR驱动的特定基因编辑或敲除以及由此产生的被扰动的基因表达谱。

将CRISPR编辑与细胞表型相关联，以单细胞分辨率将CRISPR编辑与基因表达表型直接关联。获得更深入的见解，通过单细胞全转录组或靶向基因表达获得全面的见解，而不仅仅是细胞状态。扩展您的CRISPR筛选，分析成千上万个细胞中数百个基因的遗传扰动效应。缩短分析时间，与细胞存活分析所需的长时间培养相比，更快获得基因表达结果。单细胞分辨率，逐个细胞地大规模分析疾病通路和扰动效应。简化数据分析，通过易用的软件来探索扰动后的基因表达谱。

1. 设计CRISPR文库
选择您想要进一步研究其功能的目标基因——您既可以选择数十个基因来深入研究，也可以选择构成多条通路的数百个基因来广泛筛选。然后，从多个免费的CRISPR向导RNA设计工具中选择一个来设计您的sgRNA，并订购，将其克隆到采用10x Genomics捕获序列的CRISPR载体中。

2. 制备样本
转导并刺激细胞 - 感染细胞，选择表达CRISPR向导的细胞，然后施加刺激物。收集细胞，开始探索成千上万个细胞。按照洗涤、计数和浓缩细胞的最佳做法，尽量减少细胞团块的存在，并回收高质量的单细胞悬液。

3. 构建10x文库
采用我们的试剂盒和兼容的Chromium仪器构建带有条形码的10x文库。Chromium仪器家族的任一平台将每个细胞和一个带有10x条形码的凝胶珠封装在单个液滴中。在每个纳升级的液滴中，mRNA和细胞表面蛋白对应的转录本都经过逆转录生成cDNA，其中单个细胞的所有cDNA都带有共同的10x条形码。

4. 测序
在兼容的标准短读长NGS测序仪上对生成的带有10x条形码文库进行测序，实现数千个单细胞的大规模转录分析。

5. 数据分析及可视化
Cell Ranger分析软件可自动为每个细胞分配向导，并直接评估向导对目标基因以及整个转录组的扰动效应。使用我们的Loupe Browser可视化软件，您可以交互式地探索实验结果。研究目标基因的表达模式，分析各个向导靶点所产生的扰动表型，并开展细胞簇和样本之间的比较分析。

一个总的实验流程汇总图如下：

admin 发表于 2023-5-27 22:20
其实这个在10X官网上已经介绍得比较详细了，板砖如下：

另外补充下两个常问的问题：
单细胞CRISPR筛选与大量细胞CRISPR筛选有何不同？
来自10x Genomics的单细胞CRISPR筛选能够捕获每个细胞中的CRISPR sgRNA和细胞转录本并加上条形码，以混合向导文库的形式提供扰动和表型之间的直接关联。此外，分析读数提供了每个细胞的信息，能够分辨样本中的细胞簇和亚群。

哪些类型的CRISPR经过了10x Genomics技术的验证？
CRISPR敲除、抑制和激活均经过了10x Genomics的结合Feature Barcode技术的单细胞基因表达解决方案的验证。