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CAR-T细胞已经被批准用于治疗B细胞恶性肿瘤或骨髓瘤，但在大多数实体肿瘤中的有效性仍未明确。在这些情况下，由于临床试验中成像和活检数据有限，我们仍需依赖不完美的临床前模型来增进对疗效的理解。在这篇观点文章中，作者重新评估现有的数据，并提出了一些可能的策略以提高CAR T细胞在实体肿瘤治疗中的成功率，这些策略借鉴了少数成功的实体肿瘤CAR T细胞试验和肿瘤浸润性淋巴细胞的临床经验。其中最有前景的策略包括使用多能干细胞，针对多个免疫逃避机制，使用多个共刺激域，以及开发针对CAR ligand-targeting vaccines.。此外，还应考虑采用多剂量短效CAR T细胞的策略，以预防细胞耗竭并维持有效的效应细胞群。
引言针对B细胞抗原CD19的CAR-T细胞在治疗某些复发难治性的B细胞恶性肿瘤（特别是急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤）中显示出极高的治疗效果，能够提供非常持久的反应。自体针对CD19的CAR T细胞现已得到包括美国的FDA、欧洲的EMA以及中国的NMPA在内的多个主要监管机构的认可。这些CAR-T细胞已经改变了临床治疗的现状。针对BCMA的CAR T细胞虽未能实现治愈，但已显示出显著的抗肿瘤效果，并已获得包括FDA、EMA及NMPA在内的监管机构批准用于治疗复发难治性多发性骨髓瘤患者。在部分晚期实体瘤患者中，尤其是黑色素瘤患者，体外扩增的自体肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）已展示出显著的抗肿瘤活性。然而，研发能在此类患者中具有临床效用的CAR T细胞的工作依然充满挑战，因为许多原因仍不确定，这成为了一个极具吸引力但尚未达成的目标。核心问题是“为什么？”。众多研究讨论了CAR T细胞在实体瘤患者中活性受限的可能原因，并强调了若干潜在的挑战，包括：(1) 目标抗原特异性不足（存在靶向肿瘤外毒性的风险）；(2) 迁移能力弱；(3) 持续时间短；(4) 效应功能下降；(5) 肿瘤抗原异质性。据此，构建理想的CAR T细胞治疗实体瘤的关键特征列表非常长（见box1）。 本文的目的不是在已经发表的众多综述中再增加一篇全面的综述，也不讨论与CAR-T细胞抗原选择或毒性相关的问题。为此，读者可以参考一些出色的综述文章。相反，作者将重新分析并反思目前可用的一些数据，并提出可能带来成功的研究方向。首先，会界定对抗实体肿瘤潜力的CAR-T细胞应具备的关键特性，然后探讨在临床试验中测试的现行策略在实现这些特性方面的成效。然而，分析CAR-T细胞在实体肿瘤患者中的效能颇具挑战，这主要是因为相关成像和活检样本的数据极为有限。因此，现有的知识体系主要基于从小鼠模型中推导的数据，同时也考虑到了这些模型的一些局限性。接下来，作者从先前成功的试验中提取了一些主题，并总结了从TIL治疗中学到的教训，以及同样重要的，还有一些之前针对血液癌症患者进行的靶向CD19的CAR-T细胞临床试验中可能需要忘却的教训。作者特别探讨了可能增强抗肿瘤活性的有希望的策略，并建议采用一种聚焦于使用多剂量短寿命CAR-T细胞的潜在替代策略，以预防CAR T细胞的耗竭，并因此保持一个功能性的效应细胞群体。本文不提供每个观点的详细参考文献，而是引导读者查阅过去几年的综合评论文章。然而，作者特别强调了一些特别相关的文章，无论是近期的还是在文章中未讨论的。
Box1:用于实体肿瘤患者的CAR - T细胞的关键特征描述一个在治疗实体瘤患者中最有可能成功的理想嵌合抗原受体（CAR）T细胞，其应具备以下特性。 癌症诊断后 选择的CAR结构应优先针对所有肿瘤细胞高表达并且独有的抗原。如果无法实现这种表达模式，CAR应针对所有肿瘤细胞过表达的抗原，同时对高表达该目标抗原的细胞具有选择性活性，以避免对表达该抗原低的非恶性细胞产生作用，从而防止对非肿瘤细胞的靶向作用。理想的CAR应同时针对多种肿瘤抗原，以此避免因抗原逃逸导致的耐药性。此外，理想的目标抗原还应具有肿瘤促进作用，以减少由免疫编辑导致的抗性变异体出现的风险。CAR构造的信号域应保证CAR-T细胞的活性持久，并避免导致细胞快速衰竭的持续信号。 在注射到病人体内之前 成功生产CAR-T细胞需要完成多个关键步骤。在当前多数步骤中，包括完成采集（apheresis）、细胞激活、基因修饰、以及细胞的冷冻与储存，期间还需确保避免细胞坏死、激活诱导的细胞死亡、同类杀伤或污染。此外，还需要在短时间内从数量有限的自体T细胞中培养出大量功能强大的CAR-T细胞。 注射到病人体内后 经静脉注射后，成功的CAR-T细胞首先必须避免攻击肺部等关键血管细胞，以防止立即出现毒性反应。这些注入的细胞还需克服其自然趋向，即本能地迁移到次级淋巴器官和骨髓的倾向，而应穿行、停靠并穿透肿瘤血管。 到达肿瘤后 成功穿越肿瘤血管的CAR-T细胞必须进一步穿过肿瘤基质，这一过程需要克服包括血管周围细胞和细胞外基质等重大物理障碍。此外，这些CAR T细胞还需要在严苛和免疫抑制的肿瘤微环境中存活下来，并持续保持其杀伤功能。 理想的CAR -T细胞候必须能直接与肿瘤细胞接触并能多次有效杀伤它们。为达到此目标，CAR-T细胞需克服不利的趋化因子梯度、因肿瘤细胞ICAM1表达低而导致的突触形成受限，以及肿瘤细胞的内在抗药机制。此外，除了攻击表达特定抗原的肿瘤细胞外，理想的CAR-T细胞还应通过分泌毒性因子或激活体内免疫系统产生旁观者效应，以消灭那些不表达相应抗原的肿瘤细胞。 最终，CAR-T细胞需要能在肿瘤部位增殖，以产生更多的效应CAR-T细胞，并且理想情况下还应在体内以低水平无限期持续存在，以维持对肿瘤的监控。考虑到CAR-T细胞需要克服的诸多挑战，迄今为止尚未看到有非常成功的案例或许并不令人意外。
为什么 CAR-T 细胞在实体瘤治疗中失败了？令人惊讶的是，我们尚不明确为何CAR-T细胞在治疗实体肿瘤时的效果与在B细胞恶性肿瘤患者中的成功相比显得如此有限。针对实体肿瘤患者的大多数CAR-T细胞临床试验主要提供了关于治疗的可行性和安全性的数据，并估计了血液中CAR-T细胞的数量及其抗肿瘤活性。通常情况下，CAR-T细胞的生产基本上是行得通的，大多数情况下患者也能承受这种治疗（存在一些例外情况），并且常通过敏感的定量PCR技术在血液样本中检测到CAR-T细胞。但是，血液样本中的CAR-T细胞数量在输注后的7至14天通常达到峰值，而到了第28天通常会下降到较低的水平。在临床试验中，参与实体肿瘤研究的患者血液中检测到的CAR-T细胞数量通常只有靶向CD19的CAR-T细胞试验中成功案例的五到十分之一。研究显示，清淋通常会使血液中的CAR-T细胞数量略有增加。然而，由于CAR-T细胞进入肿瘤的能力有限（详见下文），血液中CAR-T细胞的数量是否与肿瘤中的数量相关仍然不明确。 在临床效果方面，尽管有些例外，抗肿瘤活性通常较低。有报告指出，一名脑胶质瘤患者接受了多剂量针对IL-13Ra的CAR-T细胞治疗，以及四名患有脑桥或中线胶质瘤的儿童患者中使用了GD2特异性CAR-T细胞治疗，这些病例表现出了一些引人注目的效果。有两个涉及更多患者的研究报告带来了更加鼓舞人心的结果，这些研究显示，使用针对claudin18.2的CAR-T细胞治疗胃肠肿瘤患者和使用针对GD2的CAR-T细胞治疗神经母细胞瘤患者均达到了明显的抗肿瘤效果，这些效果与在淋巴瘤患者中使用靶向CD19的CAR-T细胞的效果类似。 遗憾的是，我们对大多数测试CAR-T细胞的试验在实体瘤患者中只展示了有限临床效果的原因了解不多，这主要是因为缺乏通过连续成像以及输注后活检样本来评估CAR-T细胞迁移情况的数据。而且，评估输注后从肿瘤中提取的CAR-T细胞功能活性的研究更是少之又少。因此，我们还没有解答一些基本问题，比如：（1）有多少CAR-T细胞能够进入肿瘤内部；（2）这些细胞到达后是否能增殖或持续存在；（3）它们能维持功能状态的时间长度。如果没有这些关键问题的答案，很难确定应该在哪些方面以及如何进行必要的改善。 动物模型：进退两难由于缺少临床数据，我们对CAR-T细胞在体内的活性了解主要依赖于两种小鼠模型。绝大多数研究使用的是将人类衍生的CAR-T细胞注入到携带人类癌症细胞系肿瘤的免疫缺陷小鼠（通常是Nod-SCID Il2Rγ基因敲除的NSG小鼠）中。较少采用的方法是，将来源于小鼠的CAR-T细胞注射到经过清淋的免疫完整小鼠体内，这些小鼠携带同源性肿瘤，通常这些肿瘤位于皮下。引用英国统计学家George E. P. Box的名言：“所有模型都是不完美的，但有些模型是有用的。”这一说法非常适用于这些前临床模型（见表1）。这些模型的优缺点在2022年发表的一篇精彩的综述中有更加详尽的概述（Applying a clinical lens to animal models of CAR-T cell therapies）。 该领域的研究者普遍认为，将人类T细胞注入到NSG小鼠体内的模型提供了最多的信息，这主要是由于小鼠与人类T细胞之间的众多差异（见表1）。他们认为，使用与临床试验相同的人源CAR-T细胞进行前临床研究会更加具有相关性。然而另外一种同源模型，其中使用的是小鼠来源的CAR-T细胞，可以更好地考虑到完整肿瘤微环境（TME）、内源免疫系统的影响，以及小鼠和人类之间在细胞因子、生长因子和粘附分子（例如干扰素，这些是种族特异性的）上的差异。此外，这种模型还能评估非恶性骨髓和次级淋巴器官对CAR-T细胞功能的影响。例如，通过研究CAR-T细胞激发内源性免疫旁观者效应、激活肿瘤微环境，或测试一种能够分泌IL-18的CAR构造的影响，这些实验只有在使用免疫完整的模型中才可能进行。 一种可能解决这些问题的方法是更广泛地使用人源化小鼠。人源化小鼠是指通过CD34+干细胞或胎儿组织来重建人类免疫系统的免疫缺陷小鼠。然而，这类模型仍然具有挑战性，包括重建的不完全性、高昂的成本、注射的人类肿瘤细胞可能发生自发性排斥、异种反应性问题以及难以保证CAR-T细胞、骨髓细胞和癌细胞都与患者的HLA匹配等问题。此外，非造血细胞在根本上仍然是小鼠来源的，这可能导致前文所描述的所有问题。 最后，用于实体肿瘤小鼠模型的CAR T细胞数量，通常介于106和 107之间，这是一个关键因素。如果直接将这一比例推广到人类，将需要向患者注射高达1010和 1011个CAR T细胞，这不仅远远超过了临床试验中使用的数量，还可能增加生产难度并引发毒性反应。这种在细胞数量上的巨大差异使得将临床前的有希望结果转化到临床应用变得非常困难，可能也是CAR-T细胞疗法在实体肿瘤患者中效果有限的原因之一。 [td]| Feature | 免疫缺陷小鼠体内的人类 T 细胞 | 同系小鼠模型中的小鼠 T 细胞 | | T细胞特征 | 在注射之前，可以适当降低T细胞的活化水平，因为这样可以使它们在培养中保持更长的时间。这种做法可以减少在细胞扩增期间发生的活化诱导细胞死亡（AICD），并延长细胞的存活期。 | 需要高度活化的T细胞，但持久性有限；T 细胞在扩增过程中经历更高水平的 AICD | | 扩增 | Activated T cells have only modest expansion capacity | Activated T cells have only modest expansion capacity | | 储存 | 相对容易制造和冷冻 | T 细胞的制造更加困难，并且无法以保留功能的方式冷冻 | | 清淋 | 在小鼠模型中，小鼠已经达到最大程度的淋巴细胞耗竭，这种状态虽然没有人类的稳态细胞因子的存在，但错误地增强了植入效果的程度。这表明在这种模型中观察到的植入效果可能并不完全代表在人体中的情况。 | 为了模拟临床情况，需要进行淋巴细胞清除；这可以对肿瘤产生直接影响 | | TME特征 | TME异常：NSG小鼠没有Treg细胞，只有原始骨髓细胞，包括很少的DC | 具有完整的 TME，以及 MDSC、DC 和 Treg 细胞 | | 淋巴系统 | 仅残留淋巴结和小脾脏；异常“空”骨髓 | 完整的淋巴结和脾脏；完整的骨髓 | | 宿主免疫学特征 | 缺乏生理生长因子和细胞因子；许多小鼠细胞因子和生长因子不会与人类 T 细胞发生交叉反应，反之亦然（例如，人类 IFNγ 不会刺激小鼠 TME 细胞）；T 细胞生长因子的缺乏可能会限制 T 细胞扩增的程度；没有内源性免疫系统可以激活； | 有小鼠的生长因子和细胞因子；内源性生长因子、细胞因子与T细胞完全匹配；使研究 CAR-T 细胞对内源性免疫系统的影响成为可能 |
表一：测试 CAR-T 细胞临床前模型的比较 理解CAR-T 细胞失败的原因动物模型结果 CAR-T细胞研究和开发中需要回答的两个核心问题是：这些细胞在静脉注射后的具体去向，以及它们渗透肿瘤的实际效果如何。这些问题可以使用两种技术来解决：肿瘤活检取样和成像。
通过对肿瘤活检样本进行免疫组化、分子或流式细胞分析，能获得高分辨率的信息。这种方法在临床前研究中被广泛应用，研究者可以在不同时间点，对多个实验动物进行活检取样。然而，由于与此相关的风险、患者的不适感以及成本问题，从实体肿瘤患者处获得用于研究的活检样本的难度较大。此外，这种方法还存在其他限制，如：通常每位患者只能在一个时间点进行活检、治疗后样本的坏死问题，以及通过细针采样方法获得的材料量有限（可能引起取样偏差）。针对这些限制，CAR-T细胞成像可能是一个解决方案，它可以通过可视化方式持续追踪CAR-T细胞，帮助研究者克服传统活检的局限。 关于CAR-T细胞成像技术，常用的是PET或SPECT成像方法，具体内容可在其他文献中详细了解。直接对CAR-T细胞进行放射性标记，这种方法能高效灵敏地检测，但由于使用的同位素半衰期短，只能用于短期数据收集。另一策略是通过基因工程，将编码荧光素酶或其他酶如单纯疱疹病毒胸苷激酶、碘转运体、PSMA或二氢叶酸还原酶等基因引入T细胞，实现光学、SPECT或PET成像。这种方法灵敏度较低，可能激发免疫反应，但可连续成像，长期收集数据。 在多项临床前研究中，研究人员研究了注射到NSG小鼠体内的、带有便于成像检测的编码基因的人类T细胞的分布情况。这些研究运用了活体组织取样和CAR-T细胞成像技术。研究结果普遍一致，显示出在静脉注射后，人类T细胞首先聚集在肺部，注射后2到4小时达到峰值保留量。注射后，T细胞主要迁移到肝脏和脾脏，在12到24小时内还会在一定程度上分布到骨髓和淋巴结。虽然起初在肿瘤中的CAR-T细胞数量通常很少，但这些细胞的数量会随时间逐渐增多，注射几周后，可以在肿瘤内观察到更多的CAR-T细胞。这种积累可能是肿瘤内增殖的反映，尽管这种作用还没有详细研究。
较少研究探讨了小鼠CAR-T细胞的积聚情况。尽管如此，发现小鼠CAR-T细胞的组织分布模式与人类CAR-T细胞类似，首先在肺部出现，然后是肝、脾以及次级淋巴结和骨髓。与人类CAR-T细胞相比，小鼠CAR-T细胞在肿瘤中的积累通常会稍早出现。但与人类CAR-T细胞不同的是，输注的小鼠T细胞数量在注射后大约7到10天达到峰值，然后这些细胞逐渐消失。尽管在注射前清除淋巴细胞可以在某种程度上增加小鼠T细胞的迁移和持续性，但这与人类T细胞在肿瘤中随时间增加的增殖和CAR-T细胞数量的情况通常有所不同。
总结来看，两种模型的临床前数据显示，刚注射进去的CAR-T细胞中只有很少一部分最初能进入肿瘤。注射到小鼠中的小鼠T细胞只能维持几周时间。然而，注射到免疫缺陷小鼠中的人类CAR-T细胞则表现出数周的增殖，最终在肿瘤内聚集。 人体临床试验结果 输入实体瘤患者体内的CAR-T细胞有何反应？有些有限的数据来源于使用111 In-oxine（半衰期2.8天）标记的TILs（肿瘤浸润性淋巴细胞），这些研究主要在20世纪80至90年代由美国国家癌症研究所外科分支完成。另一份报告描述了注入卵巢癌患者体内的CAR-T细胞的定位情况。与两种小鼠模型中观察到的模式类似，这些人类数据表明最初这些细胞主要积聚在肺部和次级淋巴器官，随后在接下来的24至48小时内向肿瘤的迁移效率很低。2023 年 6 月发表的一项研究描述了111 In-oxine标记的 CAR-T 细胞在头颈部鳞状细胞癌患者体内注射 48 小时后的保留情况，全身未检测到细胞。 虽然这些技术还未经验证或批准用于临床，但现已开始采用基因标记技术（例如基因标签HSVtk42）进行成像研究。显然，利用成像技术监控CAR T细胞的位置是一个重要且未解决的需求，这能提供关于CAR-T细胞在较长时间跨度内命运的关键信息。 为什么运输到肿瘤的效果有限？ 关于这一主题的详细讨论已见于多篇综述文献。简要来说，T细胞进入肿瘤的过程首先需要循环中的T细胞识别由内皮细胞分泌并结合在其表面的趋化因子（这些内皮细胞主要位于肿瘤基质中，而非富含癌细胞的区域）。识别内皮细胞之后，是由选择素介导的滚动粘附，接着是由整合素介导的牢固粘附。在趋化因子（特别是CXCL9、CXCL10、CXCL11和CCL5）的驱动下，T细胞随后穿越到肿瘤基质中（由T细胞的CCR，如CXCR3和CCR5控制）。在这里，周围血管细胞、细胞外基质蛋白和间充质基质细胞（主要是成纤维细胞）构成了障碍物。部分T细胞穿透基质，并且更少的T细胞最终移动到富含癌细胞的区域，这一过程由肿瘤衍生的趋化因子指引，它们在这些区域可以杀死肿瘤细胞，此过程需要与肿瘤细胞上的ICAM1结合。这个过程效率极低，导致很少的T细胞能成功与肿瘤细胞进行交互。存在许多原因解释这种情况，包括趋化因子与CCR不匹配、粘附受体缺失以及细胞外基质作为屏障等（见图1）。
另一个重要但常被忽视的问题可能是CAR-T细胞被误引导到淋巴组织从而远离实体肿瘤。迄今为止，CAR-T细胞产品主要受到针对CD19的产品在B细胞白血病或淋巴瘤患者中进行试验的数据的指导，这些数据强调了淋巴结以及骨髓中的迁移扩增和抗肿瘤活性的持续性的重要性。已知表达CCR7和CD62L水平高的T细胞倾向于优先迁移到淋巴结或骨髓。因此，大多数当前protocol的目标是生产主要具有中央记忆（CD62L高表达和CCR7高表达的CD45RO+）表型的CAR-T细胞，而不是效应记忆细胞（CD62L低表达和CCR7低表达的CD45RO+）表型（见图2），后者通常不利于迁移到肿瘤。下文详细讨论了解决CAR-T细胞误引导的方法。
还应考虑两个额外的注意点。首先，冷冻保存可能影响CD62L的表达，从而影响其迁移效果：据报道，在细胞解冻后，CD62L的表达会有所减少。其次，已有研究表明CD62L可能通过其他机制促进抗肿瘤活性，特别是在T细胞受体（TCR）引导的情况下，CD62L可能指导T细胞朝向一些实体肿瘤中存在的三级淋巴结构内的高内皮小静脉迁移。这些淋巴结构可能有助于促进T细胞的浸润，从而提升抗肿瘤免疫响应。 持久性 在涉及实体肿瘤患者的CAR-T细胞临床试验中，关于CAR-T细胞的持久性，迄今为止几乎每项试验都仅通过使用定量PCR或者流式细胞术检测血液样本中的CAR-T细胞。这些研究的数据相当一致。在几乎每个实体肿瘤试验中，血液中的CAR-T细胞DNA转录本数量范围在103-104拷贝/ug之间，且CAR-T细胞仅在输注后大约一个月内可检测到，通常在10至14天达到高峰。相比之下，大多数成功的针对CD19的CAR-T细胞试验在白血病患者血液中发现CAR-T细胞的数量很高，通常是105-106拷贝/ug，且常常能持续数月至数年。一个有趣的例外是涉及儿童神经母细胞瘤患者的成功试验，该试验中注意到血液中循环的靶向GD2的CAR-T细胞水平非常高（峰值平均约为2 × 10^5拷贝/ug，持续时间可达2年）。有限的数据表明，通过清除淋巴细胞，可以在一定程度上增加实体肿瘤患者中循环CAR-T细胞的水平。 相较于血液样本的分析，只有极少数研究检查了肿瘤组织内CAR-T细胞的存在及其持续性。可用的有限数据通常来自肿瘤活检样本（而非通过成像技术），但这些研究的局限性在于缺乏一致的活检样本采集条件，如采样时间和地点，样本量也小，以及难以从同一患者多次获取活检样本。例如，有几项涉及实体肿瘤患者的临床试验中，数据是基于在静脉给药后从部分患者中获得的活检样本：（1）向间皮瘤、胰腺癌或卵巢癌患者输注的针对间皮素的CAR-T细胞；（2）向脑胶质瘤患者输注的针对EGFRvIII的CAR-T细胞；（3）向前列腺癌患者输注的装备有dominant-negative TGFβR2基因的针对PSMA的CAR-T细胞；（4）向淋巴瘤患者输注的针对CD19的CAR-T细胞（见图3）。2023年3月，另一项涉及给予淋巴瘤患者靶向CD19的CAR-T细胞治疗的试验中发布了类似的活检结果。使用qPCR或者ISH来确定活检样本中的CAR-T细胞数量。尽管这些数据存在局限，且各个研究之间有诸多差异，但结果一致显示肿瘤内部检测到的CAR-T细胞非常少，而且这些细胞的持久性通常有限。静脉注射后的早期阶段（7至14天），CAR-T细胞的数量通常达到最高。虽然报告中没有直接检测出CAR T细胞，但ZUMA-1研究（该研究对淋巴瘤患者使用了靶向CD19的CAR-T细胞疗法axicabtagene ciloleucel）的一份报告指出，分析baseline tumour biopsy的结果显示，那些在baseline较为炎症的肿瘤更容易出现反应。（这边的baseline怎么解释，有知道的老师同学欢迎留言）
总结来说，临床前和临床研究的结果显示，在静脉注射后，CAR-T细胞向肿瘤的迁移非常低效，而且这种迁移很可能（尽管研究不充分）在注射后不久就发生。来自人类研究的有限数据（图3）表明，进入实体肿瘤的少数CAR-T细胞持续性有限，且不会大量增殖。在这个关键问题上，现有的临床数据更接近于输入过源自小鼠的CAR-T细胞治疗的免疫完整小鼠模型，而与输入过源自人的CAR-T细胞治疗的免疫缺陷小鼠模型相比则有所不同。 瘤内 CAR-T细胞的功能 临床前研究中一个一致的发现是，在NSG小鼠体内研究的源自人的CAR-T细胞最初表现出较高的细胞毒性活性，但该活性会随时间逐渐降低。这种活性的丧失在肿瘤内的小鼠CAR-T细胞中也有出现，由于它们的持续时间通常较短，这方面的研究较少。这种CAR-T细胞活性随时间减弱的现象是可模拟且可逆的，已经通过在体外反复使用表达抗原的肿瘤细胞刺激人类CAR-T细胞来成功重现。这种活性下降与基因组和表观遗传的变化相关联。当T细胞刺激被移除时，许多表观遗传变化也是可逆的。 导致这种逐渐出现的低功能状态的原因尚未完全明了。在肿瘤微环境中存在的多种潜在因素已经在其他研究中详细说明，这些因素包括低pH值、缺氧、关键氨基酸和葡萄糖含量低引起的营养不足、高水平的活性氧、存在免疫抑制介质（例如TGFβ、PGE2、腺苷和IL-10）以及与骨髓来源的抑制细胞和CD4+调节性T细胞的抑制性细胞间相互作用。假定的T细胞内在因素包括由免疫检查点（如PD-1、CTLA4、TIM3、TIGIT和LAG3）介导的“调节性关闭”，以及抑制性的细胞内信号通路（如DGK、NR4A、SHP1和cbl-b）。此外，还有多种表观遗传变化被认为与此相关。另外，CAR特有的问题，如持续性信号的强度，也可能导致低下功能。 遗憾的是，关于临床试验中人类CAR-T细胞的表型或功能能力的数据非常有限。在一项靶向ROR1的CAR-T细胞的试验中，通过对三位患者在治疗第14天采集的血液样本的流式细胞术分析显示，这些CAR-T细胞在经CD3–CD28刺激后抑制性受体的活性增强，同时其细胞因子的产量显著下降。在另一项研究中，对注射后大约10天获取的淋巴瘤活检样本中少量CAR-T细胞的进行表型研究。这些报告提到，在这一早期时间点检测到的大部分CAR-T细胞具有正在激活中或先前已经激活的表型迹象。类似地，在一项针对脑胶质瘤患者进行的EGFRvIII靶向CAR T细胞治疗的首次人体研究中，作者们指出：“在所有接受CART-EGFRvIII输注后2周内进行肿瘤切除的四位受试者中，我们通过RNAscope ISH发现了CAR+细胞。这些T细胞包括CD8+和CD8- T细胞的混合物，许多细胞显示出激活的表型。”不过，相关的激活数据并未被提供。 尽管如此，考虑到已有的CAR-T细胞功能的临床前数据以及大量描述癌症患者中内源性TILs细胞杀伤功能丧失的文献，患者体内的肿瘤内CAR-T细胞在渗透肿瘤后的几天到几周内也很可能功能减退。关于肿瘤内CAR-T细胞功能的更多临床数据将极大地促进这一领域的发展。 总的来说，基于T细胞的癌症治疗的基本目标是提供足够数量的多功能CAR-T细胞，这些细胞具有持续靶向和消灭肿瘤细胞的能力（即功能持续性）。当前的证据显示，对于实体肿瘤患者进行CAR-T细胞治疗时的主要问题是，注射的细胞中只有很少一部分能够渗透到肿瘤中并保持其功能性（见图4）。在测试人类CAR-T细胞的临床前模型中，许多细胞在早期时间点具有很高的功能性，尽管位于肿瘤内部的细胞非常少（见图4a）。随着肿瘤内CAR-T细胞数量的增加，这些细胞逐渐功能减弱，导致只有一个短暂的时间窗口内有足够数量的功能性CAR-T细胞可用（见图4a）。这种情况与临床前模型中源自小鼠的CAR-T细胞相似（见图4b）。
肿瘤异质性和抗原扩散 与B细胞恶性肿瘤或多发性骨髓瘤（分别几乎普遍高表达CD19或BCMA）不同，实体肿瘤中的抗原表达通常较低且异质性更强。因此，除非通过CAR-T细胞引发一些旁观者效应或抗原扩散效应，或者同时针对多种抗原，否则治疗成功的可能性很低。尽管最初预测CAR-T细胞可能具有旁观者效应，但目前普遍的共识是，CAR-T细胞本身不会产生显著的旁观者效应。例如，在使用syngeneic小鼠模型的临床前研究中，针对间皮素的CAR-T细胞能够完全清除由100%表达间皮素的细胞组成的肿瘤，但当肿瘤只含有10%的不表达间皮素的细胞时，仅发生了肿瘤生长的暂时性减缓。因此，有一点值得关注：大多数针对实体肿瘤患者进行CAR-T细胞治疗的试验资格标准并未规定肿瘤细胞必须高比例表达目标抗原，有时甚至未对目标表达水平进行评估。In addition to baseline tumour heterogeneity，针对CD19的CAR-T细胞在B细胞恶性肿瘤中的试验数据以及一项涉及实体肿瘤患者的试验均表明，高活性的CAR-T细胞能够施加选择压力，导致由于抗原阴性（或抗原突变）肿瘤细胞的生长，疾病复发。（这里In addition to baseline tumour heterogeneity该怎么翻译，有知道的老师同学欢迎留言）
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