qPCR验证结果和测序结果不一致，怎么办？

qPCR验证结果和测序结果不一致，可能有如下几种原因：

      可能原因：筛选的基因表达值、差异显著性；Ct/cq值；复孔数；引物设计与筛选；样品批次效应；实验原理与计算方法差异等，比对组信息是否弄反；样品是否有污染（核糖体、支原体、菌类等）或降解。

1.  用于qPCR定量检测的基因，表达量偏低，需要多次扩增，会导致Ct值偏高；或挑选的基因差异不显著（差异倍数较低，或FDR值较高）。

2.  qPCR验证和测序的样品是否为同一份样品？RNA的表达具有组织和时空特异性，不同的培养条件都会有不一样的表达。

3.  是否是同一批次样本，存在批次效应。

4.  测序是否有生物学重复？
     没有生物学重复，结果容易受随机因素的影响，进而影响筛选基因准确性，使表达验证困难。
     通常，qPCR验证的样本要多于测序的样本，即：在包含测序样本的同时，增加样本量用于qPCR验证。
     理论上，只用测序的样本进行qPCR验证的话，即使两种结果的趋势一致，也只能证明测序结果是正确的，不能确定此结果是否能代表大部分群体。所以，qPCR验证时， 最好增加样本量，以证明测序结果的代表性。

5.  某些样本如果降解、有污染的话，可能对qPCR定量和测序分析结果造成影响。
     比如，小RNA测序，其他RNA降解的小片段，可能qPCR验证时检测到，也可能会构建入小RNA测序文库，影响小RNA定量准确性。
     样品有污染（核糖体、支原体、菌类等），会降低测序有效数据量，影响miRNA的表达量计算。

6. 两种方法本身存在差异（检测原理和计算公式不同），出现不一致情况。
     测序是大规模筛选用的，从整体水平反应样本的基因表达变化趋势，但，不能保证每一个基因的变化趋势都与qPCR保持一致。测序与RT-PCR本身就是两种不同技术（原理不同、计算公式不同），两者不能完全一一对应，也属正常。
      建议仅关注两种检测结果的变化趋势是否一致，如上/下调变化趋势,而不是表达定量的值以及差异倍数（一定范围内的差异是不可避免的。）

7. 样品对比关系搞反了。
      这个需要对照测序公司的原始数据，查看结果.

8. 排除了以上所有可能后，结果还不一致的话，可检查QPCR结果是否正确（实验方法、复孔数量和表达量、计算公式等）。
      如果只验证一个基因/小RNA的话，如果确定qPCR没有问题的，那就以qPCR为准。如果挑了20个基因，结果都不一致的话，排除了以上所有可能后，那要检查qPCR和测序数据的分析是否有问题。

根据上述可能，挑选基因进行qPCR验证的建议如下，仅供参考

      首先，验证实验不只是为了验证而验证，最好还应该有生物学意义。

      请老师挑选感兴趣、与研究目的相符的基因，换句话说，根据研究目的选择基因（生物学意义与研究目的相关的基因）去验证，这样既符合研究预期，也便于撰写文章内容。
      其次，是挑选基因的原则

        1.  基因表达量高（至少在一个样品中的表达量RPKM/FPKM大于50，或者RPKM＞中位值）；
        2.  基因测序深度read count值相对较高，如有些研究人员选择read count大于20；
        3.  差异倍数大（log2(FC)）；
        4.  基因长度。
        5.  重复样本间，表达量稳定。
        6.  最后，内参的选择也很重要，要看一下内参基因在各样本中的转录组表达量数据是否相对稳定。因为QPCR定量计算都是以内参作为基准的。

       上述几条标准的指标，目前没有统一固定的标准，需要研究人员根据自己的研究需要进行选择。
       上述只是筛选基因的原则，等筛选出基因后，还要根据实时定量引物设计原则，检测此基因序列是否能设计出合适引物。
       一般会挑选多个目的基因去验证（10个-20个，然后，选择验证结果与预期一致的基因去写文章。）
注意：用QPCR验证RNA-Seq结果，由于两种技术本身存在较大差异，RNA-seq是大规模筛选用的，反应样本整体的基因表达变化趋势，但不能保证每一个基因的变化趋势都与qPCR保持一致。RNA-seq与RT-PCR本身就是两种不同的技术，两者不能完全一一对应，也属正常。
所以，建议仅关注两种基因表达的检测结果变化趋势是否一致，如上/下调变化趋势,而不是表达定量的值以及差异倍数（一定范围内的差异是不可避免的。）

      以lncRNA测序数据为例，按照上述原则挑选RNA分子的话，步骤如下，仅供参考
      差异lncRNA筛选建议（qPCR验证）：
     1.  表达量较高（RPKM值较大）的lncRNA。
      表达量偏低的lncRNA/基因，qPCR验证结果可能不太准确。对于表达量的高低判断，目前还没有统一公认的标准，可根据样本整体表达水平自行设置最低阈值，或挑选表达量较高（RPKM＞平均值或中位值）的lncRNA进行验证。
      RPKM值与基因表达丰度（目前只看到到少数RPKM与表达丰度判断的说法，如下）
      1. 业界有公司的参考建议：RPKM 在0.1 -3.75之间可认为是低丰度表达水平的基因；RPKM 在3.75 -15 之间为中等丰富度表达水平基因；RPKM＞15为高丰富度表达水平基因。
      2. 也有观点认为：RPKM在1-3之间为低表达基因，3-30为中表达基因，30以上的为中高表达的基因。
      3. 因为不同组织、样本的基因表达丰度差异较大，有客户选择RPKM＞平均值或中位值的基因。
      目前尚未有权威杂志和文献上报道明确、公认、统一的指标。所以，需要您结合研究目的确定表达量的筛选标准。

2.  在表达量较高的基础上，选择差异倍数较大的lncRNA。
     如差异倍数（|log2(Fold_change)|＞1）、显著性（q-value＜0.001极显著），这是差异分析中的默认参数，可进行调整。

3.  根据研究目的，结合信号通路，挑选不同位置的lncRNA。
     如果研究lncRNA与miRNA结合，进而调控mRNA，可选择与基因重叠的lncRNA（Antisense lncRNA、sense lncRNA、pseudogene）等。
     如果研究lcnRNA调节基因转录功能，可选择位于基因间区的lncRNA（Promoter-associated lncRNA 、Large intergenic noncoding RNA）等。
     根据已发表文献，查找与研究目的（或疾病）相关的KEGG pathway及GO Term，在测序结果的KEGG和GO的结果表格中搜索相应的pathway和term名称，查看此pathway和term相关的靶基因（表格最后一列），查看这些靶基因对应的靶向lncRNA。

     lncRNA选择因素
      

信息来源：https://www.omicshare.com/forum/thread-5048-1-1.html