48 A Modified Triple Transfection Method Produces High-Quality AAV Vectors with Much Reduced Plasmid Demand
Hao Liu, Yue Zhang, Mitchell Yip, Lingzhi Ren, Jialing Yang Liang, Jote Bucha, Nan Liu, Ailing Du, Jiaming Wang, Hao Chang, Oh Hyejin, Chen Zhou, Ruxiao Xing, Mengyao Xu, Mengtian Cui, Xiupeng Chen, Jisun Lee, Jinchen He, Jun Xie, Phillip WL Tai, Guangping Gao#, Dan Wang#
Horae Gene Therapy Center, The University of Massachusetts Chan Medical School, Worcester, MA
HEK293细胞的三重转染是制备重组腺相关病毒（rAAV）最常用的方法。该方法涉及将三个质粒以大致等摩尔比例共转染至细胞中：一个传辅助质粒（pAd-Helper），用于传递腺病毒的某些基因；一个表达AAV rep和cap基因的转座质粒（pTrans）；以及一个含有AAV倒向末端重复序列包围的治疗转基因组的顺式质粒（pCis）。虽然三重转染取得了巨大成功，但当它被越来越多地用于生产临床级rAAV并经过先进技术的审查时，出现了新的问题，如GMP质粒的成本过高和在纯化的rAAV中检测到警示性水平的质粒骨架DNA。
在这里，我们描述了一种改良的三重转染方法，通过大大减少质粒需求来提高rAAV批次的数量和质量。最近，我们将基于AAV的基因传递与抑制子tRNA介导的终止密码子读穿机制相结合，开发了AAV-NoSTOP（Wang J.等，Nature 2022），一种针对致病无义突变的体内基因治疗方法。当我们尝试扩展AAV-NoSTOP工具箱时，发现无法通过标准的三重转染将某些抑制子tRNA基因封装入rAAV中。从机理上讲，我们发现在HEK293细胞中，pCis中的抑制子tRNA的表达干扰了pTrans中的rep/cap表达。令人惊讶的是，将转染的pCis量减少到1%就允许了rep/cap表达，并成功产生了rAAV。这些结果促使我们进行了一系列的比较研究，证明将pCis减少到标准三重转染中使用量的1%对于单链和自补性载体基因组、各种报告基因和外壳蛋白以及不同的生产规模是广泛适用的。所得到的rAAV产量与标准三重转染相比基本相当或稍有降低。除了使用更少的质粒外，使用1%的pCis的另一个优点是提高了载体DNA的纯度。具体来说，PacBio测序显示它显著降低了穿透读错和逆封装的含有pCis质粒骨架的载体DNA的比例（从标准三重转染中的4.4%降至0.7%），这可能导致转导组织中不期望的RNA表达和先天免疫反应。最后，小鼠的体内研究表明，使用1%的pCis生产的rAAV在基因型、血清型和特定组织中具有优越的转导效率。总之，我们开发了一种改良的三重转染方法，易于实施、具有成本效益，并能够产生高纯度和高效力的rAAV。（#共同通讯作者）
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