如何分析Sanger测序峰图？

Sanger测序是大家最常打交道的测序方法。但是，大家拿到测序结果的时候，是不是会满脸疑惑？杂乱无章的峰图怎么看？什么是信号中断？各种峰图产生的原因又是什么？

别急，今天我们给大家介绍一下常见的几种测序结果的峰图和原因分析，有图有真相！

1. 测序成功峰图

特征描述：峰形图单一、清晰、明确




Sequence Scanner 软件中Raw图实例：

注：QS（Quality Score）值为有效信号参考值，CRL(Countiguous Read Length)为有效读长参考值。部分PCR样品测序到A尾后仍会出峰，为测序仪信号背景可忽略，以实际结果为准。Sequence Scanner 软件可在金唯智官网-服务资源-序列查看工具中下载。

2. 中断峰图

特征描述：起始峰形良好，随后出现底峰或信号中断

例1：800bp前信号读值突然中断



例2：PolyG或PolyC后，信号突然降低，最后导致中断



例3：起始峰形图良好，随后底峰拉高



Sequence Scanner 软件中Raw图实例:



3. 套峰峰图

特征描述：测序峰图为非单一峰型

例1：质粒或菌液（非单一克隆）起始峰形图良好，随后出现套峰无法辨别主峰




例2：非单一克隆或引物与模板有多个结合位点出现从头到尾的套峰



注：建议重新制备模板或更换引物尝试测序。

例3：PCR（点突变）引起非单一峰形



例4：PCR样品含有多套模板，导致非单一峰形


例5：引物降解或引物合成时碱基遗漏，导致峰图前（后）移，产生非单一峰形

注：重新合成新引物安排测序


例6：测序方案引起的测序前端套峰，后续峰图恢复正常


注：可联系技术支持调整方案安排重测

例7：序列含有高变区，起始峰图很好，突然出现套峰，若干bp后峰图又恢复正常



例8：Poly结构(重复碱基)导致测序结果出现非单一峰形



4. 无信号峰图

特征描述：序列峰图杂乱无章，测序干扰较大，没有明显主峰



Sequence Scanner 软件中Raw图实例：


5. 衰减峰图

特征描述：起始峰图良好，逐渐出现底峰干扰主峰读值；或主峰逐渐降低，最终在800bp前无法正确读值




Sequence Scanner 软件中Raw图实例：




6. 弥散峰图

特征描述：起始峰形较好，后逐渐变宽，导致序列800bp前无法准确读值

例1：刚开始峰图良好，到后边（800bp之前）峰变宽以至于无法识别



Sequence Scanner 软件中Raw图实例


例2：延迟出峰，峰变宽逐渐不能识别



Sequence Scanner 软件中Raw图实例



7. 光谱拉高峰图

特征描述：T峰拉高G、A、C峰，导致序列800bp前出现非特异峰形



Sequence Scanner 软件中Raw图实例:




8. 气泡峰图

特征描述：峰图正常，突然在某处出现信号值很高的一团杂峰，特点为中心为空，干扰该处主峰读值



SequenceScanner 软件中Raw图实例:




9. Dyeblob染料峰峰图

特征描述：在测序结果的80bp，由于测序副产物产生有一个“大气泡”

注：提高样品浓度，可联系技术支持查看是否可以调整方案重测。

注：本文来着安升达微信公众号，请访问原始地址：https://mp.weixin.qq.com/s/XkNdswlcTKftQJ6cROhd_g