基于高通量测序（NGS）的杂交瘤抗体基因测序新方法

近四十年来，抗体药物以其特异性强和安全性高的优势成为医药领域的新热点和未 来趋势。自从第一个单克隆抗体药物莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3)在 1986 年被批 准上市以来，全球范围内目前已有 165 个抗体药物已经或正在被审批。这些药物的开发 已经成功应用在治疗包括癌症，自免疫综合征，代谢紊乱和传染病等在内的各种疾病。近 年来，随着关键领域技术的进步和理论上的创新，抗体药物不在局限于单克隆抗体，而是 演化出了双特异性抗体(bispecific antibody)，纳米抗体，抗体偶联药物（antibody-drug  conjugates, antibody-conjugated nuclides）。此外，治疗性抗体通过结合其它技术， 逐渐形成并建立了以 CAR-T, CAR-NK 为主流技术方案的细胞治疗领域。

单克隆抗体（mAb）作为抗体药物中开发最终发展最快的大类，目前仍然是各家公 司投入研发的重点。截止到 2022 年七月，一共有 123 个 mAbs 被批准上市，其中 65 个 新 mAbs 是在 2021 年以后批准的 。作为开发最为成熟和最热门的靶点（如下 a 图）， PD-1 有 13 个抗体药物被批准上市。国内药企乐普生物开发的 anti-PD-1 的普特利单抗 注射液(Pucotenlimab)于 2022 年 7 月 19 日在中国获批用于肿瘤的治疗。单抗药物也 是目前市场上最流行的药物，在 2021 年里前 50 最高销售额中，22 个药物是抗体药物。销 售 额 最 高 的 抗 体 药 物 是 由 AbbVie 开 发 的 用 于 治 疗 风 湿 病 的 阿 达 木 单 抗 （adalimumab），其年均销售额超过 200 亿美元，名副其实的重磅炸弹。在过去的 8 年 时间中，全球抗体药市场实现了超过 10%以上的持续增长，并在 2021 年首次超过了 2000 亿美元。即便如此，随着各大制药公司手中的抗体研发管线的持续推进，单抗药的市场仍 然会持续增加（如下 b 图）。



传统抗体药物研发的一般流程，大致可以分为发现，开发，测试，生产这几个阶段。抗体发现是指从生物体细胞中识别和分离出特异的功能性抗体。从 1975 年杂交瘤技术问 世，治疗性抗体的发现策略逐渐进化创新，目前已包含杂交瘤技术，噬菌体展示技术，人 源化小鼠技术，单 B 细胞发现技术和人工智能（AI）相关等相关技术（如下图）1。在许 多情况下，可能需要采用多种方法的组合才能确定药物治疗的目标和结合机理，十分耗时。截止到目前，小鼠杂交瘤技术仍然是抗体发现中应用最为广泛，且最为成功的方法，大部 分获批的治疗性抗体药物均是通过小鼠杂交瘤技术获得。



然而，在实验室中，杂交瘤细胞是脆弱又不稳定的，需要严格的操作控制来维持细胞 系的生存能力。即使付出大量时间和精力，细胞系仍然有可能生长不良甚至细胞死亡。许 多因素（包括长时间保存，反复的冻融循环，不正确的处理，细菌污染等）都可能导致杂 交瘤的失活，从而造成抗体的永久丢失。其次，由于基因突变和重排的发生，杂交瘤技术 的批次间差异和低重复性也一直为人诟病。在 2018 年，一项对 185 个杂交瘤细胞系的 研究中，研究者发现近三分之一的细胞系中含有多余的抗体基因，影响了对靶抗原的亲和 力和特异性 2。此外，杂交瘤甚至可能随着时间的推移丢失含有抗体基因的染色体，这就 完全阻断了抗体的产生。再次，一次动物免疫到生产抗体的过程就需要至少三到六个月的时间，耗时长，工作量大，却通量低。因此，将杂交瘤细胞中的抗体基因进行测序并进行 重组化表达是当前的主流的抗体生成模式。

抗体测序——重组抗体第一步

制备重组单克隆抗体的首要条件，是获得抗体的序列信息，目前的抗体测序技术主要 为基于基因组学的杂交瘤测序（Hybridoma Sequencing）。杂交瘤细胞测序，是对从杂 交瘤细胞中提取的 RNA 进行反转录得到 cDNA，再用 PCR 对其进行扩增，进而获得抗 体重链和轻链的完整序列信息 。大容量和多样性好的抗体基因库是成功筛选功能抗体的 基础，因此需要匹配高通量的抗体测序，快速检测大容量重组抗体基因库和多样性抗体库。 当前基于 PCR 扩增和 Sanger 测序的流程是大多数实验室采用的抗体测序方法。在 该流程中，通过将 PCR 扩增后的抗体序列克隆到测序载体中，然后再转染到大肠杆菌进 行培养和挑斑，最后通过对重轻链少量的克隆（通常各 10 个）进行 Sanger 测序从而确 定“正确的”杂交瘤抗体序列。这个流程成功的前提是杂交瘤样本中真正对的抗体序列丰度 要高于其它异常抗体序列，否则很难测序得到对的序列（如下图），解决办法就需要加大 挑斑测序的克隆数，造成成本和周期的急剧增加。这个流程非常耗时耗力，且处理测序样 本通量低，整体成本也不便宜。



随着高通量测序技术（NGS）的快速发展，其测序质量，通量和周期都有非常大的提 升，并成功应用在临床肿瘤，病原菌检测领域。NGS 对同一样本进行高深度测序，可以 检测出样本中超低丰度核酸序列的信息；对同一核酸分子进行多次重复测序，可以得到该 分子非常高测序准确度的结果。因此，利用高通量，高准确性，低成本的 NGS 方法进行 杂交瘤抗体测序目前已逐渐成为主流的抗体测序方法，已经成功应用在对重组抗体库多 样性的分析及基于抗体可变区 VDJ 序列测序结果的应用。